用于合成5’-加帽RNA的组合物和方法

本专利的专利号为202310734863.0，其是申请号为201680067458.6的发明专利申请的分案，优先权日为2015年09月21日，申请日为2016年09月20日，授权公告日为2024年01月30日。本专利授权公告时的权利要求书共45项。 请求人于2025年01月22日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，其理由是说明书对权利要求1-45的技术方案公开不充分；权利要求1-45保护范围不清楚，并且得不到说明书的支持；权利要求1-45的修改超出原申请记载的范围；权利要求1-45缺少必要技术特征；权利要求1-6、9、10、14、15、32不具备新颖性；权利要求1-45不具备创造性。请求宣告本专利权利要求1-45全部无效，同时提交了如下证据： 证据1：William P. Kennedy 等，Mechanism for De Novo RNA Synthesis and Initiating Nucleotide Specificityby T7 RNA Polymerase，公开日：2007年03月21日，及其部分中文译文； 证据2：WO2008016473 A2，公开日：2008年02月07日，及其部分中文译文； 证据3：mMESSAGE mMACHINE® Kit 用户手册，公开日：2012年10月10日，及其部分中文译文； 证据4：WO2009058911 A2，公开日：2009年05月07日，及其部分中文译文； 证据 5：Janusz Stepinski 等，Synthesis and properties of mRNAs containing the novel “anti-reverse” capanalogs 7-methyl 3’-O-methyl)GpppG and 7-methyl 3’- deoxy)GpppG，公开日期：2001年，及其部分中文译文； 证据6：Jacek Jemielity 等，Novel “anti-reverse” cap analogs with superior translational properties，公开日期：2003年，及其部分中文译文； 证据7：Masahide Ishikawa 等，Preparation of eukaryotic mRNA having differently methylated adenosine at the5'-terminus and the effect of the methyl group in translation，公开日：2009年09月27日，及其部分中文译文； 证据8：Tricia M. Coleman 等，Superior 5' homogeneity of RNA from ATP-initiated transcription under theT7 φ2.5 promoter，公开日：2004年01月15日，及其部分中文译文； 证据 9：John F. Milligan 等，Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNAtemplates，公开日期：1987年，及其部分中文译文； 证据10：Satu Mikkola 等，Preparation and Properties of mRNA 5´-cap Structure ，公开日期：2005年，及其部分中文译文； 证据11：Kazuo Yamaguchi 等，Chemical synthesis of the 5'-terminal part bearing cap structure of messengerRNA of cytoplasmic polyhedrosis virus (CPV): m7G5’pppAmpG and m7C5’pppAmpGpU，公开日期：1984年，及其部分中文译文； 证据12：Diane Imburgio 等，Studies of Promoter Recognition and Start Site Selection by T7 RNA PolymeraseUsing a Comprehensive Collection of Promoter Variants，公开日：2000年08月04日，及其部分中文译文； 证据13：WO2011157617A1，公开日：2011年12月22日，及其部分中文译文； 证据14：US7074596B2，公开日：2006年07月11日，及其部分中文译文； 证据15：Molecular Biology of THE CELL Fifth Edition，Garland Science，公开日期：2008年，及其部分中文译文； 证据16：Simon E. Moroney等，Abortive Products as Initiating Nucleotides during Transcription by T7 RNAPolymerase，公开日期：1991年，及其部分中文译文； 证据17：Lodish 等，Molecular cell biology Sixth Edition，W. H. Freeman and Company，公开日期：2008年，及其部分中文译文； 证据18：Yutaka Suzuki 等，Diverse transcriptional initiation revealed by fine, large-scale mapping of mRNAstart sites，公开日期：2001年，及其部分中文译文； 证据19：Sang-Chul Nam 等，Transcription Initiation Site Selection and Abortive Initiation Cycling of PhageSP6 RNA Polymerase，公开日：1988年12月05日，及其部分中文译文； 证据20：Iaroslav Kuzmine 等，Binding of the Priming Nucleotide in the Initiation of Transcription by T7 RNAPolymerase，公开日：2003年01月31日，及其部分中文译文； 证据21：US8557972B2，公开日：2013年10月15日，及其部分中文译文； 证据22：Kim Baert，Exploratie van de wisselwerking tussen de prognostische merkers bij chronische lymfatischeleukemie，公开日期：2010年，及其部分中文译文； 证据23：Sergey V. Slepenkov 等，Stopped-flow Kinetic Analysis of eIF4E and Phosphorylated eIF4E Bindingto Cap Analogs and Capped Oligoribonucleotides，公开日：2006年05月26日，及其部分中文译文。 经形式审查合格，国家知识产权局于2025年01月27日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。 专利权人针对上述无效宣告请求于2025年02月27日提交了意见陈述书，并修改了权利要求书（共43项），所述修改为：将授权公告的权利要求10、33中的技术特征“R 为O-甲基”限定入独立权利要求1、 332中，删除权利要求9、10，并相应修改权利要求的编号。修改后的独立权利要求1、30为： “1.复合体，其包含起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板，所述起始加帽寡核苷酸引物包含以下结构： 其中： B 和B 独立地为天然的、修饰的或非天然的核苷碱基；和1 2R 、R 和R 独立地为OH或O-甲基， 1 2 3其中R 为O-甲基， 3其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区域，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸；以及其中所述起始加帽寡核苷酸引物与所述DNA模板至少在核苷酸位置+1和+2处杂交。”“30.复合体，其包含起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板，其中所述起始加帽寡核苷酸引物包含以下结构： 其中： B 、B 和B 独立地为天然的、修饰的或非天然的核苷碱基；和1 2 3R 、R 、R 和R 独立地为OH或O-甲基； 1 2 3 4其中R 为O-甲基； 3其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区域，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸、在核苷酸位置+2处的第二核苷酸和在核苷酸位置+3处的第三核苷酸；以及其中所述起始加帽寡核苷酸引物与所述DNA模板至少在核苷酸位置+1、+2和+3处杂交。”专利权人同时提交了以下反证： 反证 1：Shirley S. Daube 等,“Functional Transcription Elongation Complexes from Synthetic RNA-DNABubble Duplexes”，Science，第258卷，第1320-1324页，公开日1992年11月20日，及其相关段落译文； 反证 2：Homo sapiens actin gamma 1 (ACTG1), transcript variant 1, mRNA, NCBI Reference Sequence: NM_001199954.3，及其相关段落译文； 反证3：Sahin, U.等，BNT162b2 vaccine induces neutralizing antibodies and poly-specific T cells in humans ， Nature，第595卷，第572–577页，公开日期2021年，及其相关段落译文； 反证4：Kamzolova, S. G. 等，Electrostatic map of T7 DNA: comparative analysis of functional and electrostaticproperties of T7 RNA polymerase-specific promoters, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics，第32卷第8期，第1184–1192页，公开日期2013年，及其相关段落译文； 反证5：Arnaud-Barbe N 等， Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase，Nucleic Acids Res. 第26卷第15期，第3550-3554页，公开日期1998年，及其相关段落译文； 反证 6：Amy E. Pasquinelli 等，“Reverse 5’caps in RNAs made in vitro by phage RNA polymerases”RNA，第1卷，第957-967页，公开日期1995年，及其相关段落译文； 反证7：Zheng-Hong Peng 等，Synthesis and Application of a Chain-Terminating Dinucleotide mRNA CapAnalog，Organic Letters，第4卷第2期，第161-164页，公开日期2002年，及其相关段落译文； 反证8：ALIX SALVAIL-LACOSTE 等，Affinity purification of RNA with homogeneous ends，RNA，第19卷第7期，第1003-1014页，公开日期2013年，及其相关段落译文； 反证9：Minqing Rong 等，Template Strand Switching by T7 RNA Polymerase，J. Biol. Chem.，第273卷第17期，第10253-10260页，公开日1998年04月24日，及其相关段落译文； 反证10：四聚体 m7GpppA pG pG的补充实验数据； 2’Ome 2’Ome反证11：请求人证据1补充中文译文； 反证12：请求人证据2补充中文译文； 反证13：请求人证据4补充中文译文； 反证14：请求人证据9补充中文译文； 反证15：请求人证据12补充中文译文； 反证16：请求人证据13补充中文译文； 反证17：请求人证据16补充中文译文； 反证18：请求人证据20补充中文译文。 专利权人认为，在修改后的权利要求书的基础上，请求人的无效理由均不能成立。 国家知识产权局本案合议组于2025年02月28日将专利权人于2025年02月27日提交的意见陈述书及其附件转送给专利权人。 请求人于2025年03月27日提交了意见陈述书、证据20的另一段内容的中文译文及以下证据（编号续前）： 证据24：Y. Whitney Yin 等，Structural Basis for the Transition from Initiation to Elongation Transcription inT7 RNA Polymerase，公开日：2002年11月15日，及其中文译文； 证据 25：引物序列 TM 值（包括 GGACACGGCGAA、CACACGGCGA、mAG、mAGG、polyU20、 polyT20）； 证据26：专利权人反证1补充中文译文。 合议组于2025年03月28日将请求人于2025年03月27日提交的意见陈述书及其附件转送给专利权人， 并于2025年03月31日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2025年05月07日举行口头审理。 专利权人于2025年04月27日针对请求人的意见提交了意见陈述书，合议组于2025年04月28日将上述文件转送给请求人。 口头审理如期举行，双方当事人均委托代理师出席了本次口头审理。在口头审理过程中，当庭明确并记录的事实如下： 1、 请求人对于专利权人于2025年02月27日提交的权利要求书的修改没有异议，明确针对修改后的文本的无效理由为：说明书对权利要求1-43的技术方案公开不充分；权利要求1-43的保护范围不清楚，并且得不到说明书的支持；权利要求1-43的修改超出原申请记载的范围；权利要求1-43缺少必要技术特征；权利要求1-6、12、13不具备新颖性；权利要求1-43不具备创造性。 2、 请求人当庭提交公知常识性证据（Roland Karl Hartmann等编，《handbook of RNA Biochemistry》， 第1卷，Copyritght©2005 WILEY-VCH Verlag GmbH& Co.KGaA,Weinheim，部分内容复印件及复制证明、 译文）（下称证据27），专利权人当庭提交公知常识性证据（杨荣武主编，《生物化学原理》，高等教育出版社，2012，部分内容复印件及复制证明）（下称反证19）以及证据20的补充译文，合议组当庭将双方提交的上述文件转送给对方。 3、 关于质证意见。专利权人不认可证据3、22的真实性、合法性，并认为其公开日晚于证据2的公开日，不能用于与证据2结合评述本专利的创造性；不认可证据25的关联性，认为证据27中没有记载版次等信息，不认可证据27的公开时间；对其它证据的真实性、合法性、关联性、公开日期、译文准确性等未提出异议；专利权人认为证据3、22公开了与证据2中相同名称的试剂盒，其内容应当认定为一致，证据27的公开时间可从版权页确认。请求人认为反证10没有记载实验时间和实验人等信息，不认可反证10的真实性， 对于其它证据的真实性、合法性、关联性、公开时间、译文准确性未提出异议；专利权人认为反证10用于证明高浓度下四聚体也可以很好地转录。 4、 关于说明书是否公开充分。请求人认为，本专利对于权利要求中要求保护的复合体没有进行表征和确认，没有复合体稳定存在的依据，反证1和证据20均不能证明复合体的存在，本专利转录效率提高只能证明是转录体系的效果。专利权人明确本专利的复合物至少包括引物和模板，不必须有聚合酶存在，并认为反证1和证据20可以佐证复合体存在，而且本专利验证了转录效率提高，没有杂峰，佐证了复合体是非常稳定的。 5、 关于权利要求是否清楚以及得到说明书支持。关于清楚，请求人认为+1位的定义有不同的解释，例如从转录开始位置倒推，或者按从头合成时的位点进行标注，本领域中对于启动子位置的编号并不是唯一的， 尤其是新启动子，需要通过实验才能确定+1位。专利权人认为转录位点是客观的，本专利指代的是在从头RNA合成中，启动子上的转录起始位点为+1位。关于权利要求是否得到说明书支持，双方均坚持书面意见。 6、 关于修改是否超原申请记载的范围以及权利要求是否缺少必要技术特征，双方均坚持书面意见。 7、 关于新颖性。请求人在修改后的权利要求的基础上放弃证据2、4、5、6、23，仅以证据7评述权利要求1-6、12-13不具备新颖性，认为证据7的-1、+1位实际上也可理解为本专利的+1、+2位，在此基础上，上述权利要求不具备新颖性。专利权人坚持认为，二者位点不同，本专利具备新颖性。 8、 关于创造性。请求人明确证据组合方式均以证据7作为最接近的现有技术，权利要求1与证据7的区别为模板不同，证据8-13给出了其它模板更优的教导或者公开了其它模板，因此权利要求1相对于证据7结合证据8、12、13，或者证据7结合证据9、10、11不具备创造性，在此基础上其它权利要求也不具备创造性。专利权人认为证据7明确教导了模板与引物的杂交关系，本领域技术人员没有动机去改变杂交关系以及替换其它模板，而且反证8也推翻了证据8的结论，证据9为从头合成RNA，与证据7的加帽引物不相关， 因此请求人的意见不成立。在此基础上其它权利要求也具备创造性。 口头审理结束后，双方均提交了庭后代理词，均坚持当庭陈述的意见，专利权人还提交了以下附件： 附件1：Ashwood 等人，“Thermodynamics and kinetics of DNA and RNA dinucleotide hybridization to gapsand overhangs”，Biophysical Journal 122, 3323–3339，公开日2023年08月22日，及其相关段落译文；。 附件2：Zhang 等人，“Insight into the mechanism of nonenzymatic RNA primer extension from the structureof an RNA-GpppG complex”PNAS，第114卷，第29期，第7659-7664页，公开日2017年07月18日，及其相关段落译文； 附件3：本专利三聚体复合体和四聚体复合体在高浓度GTP条件下转录的补充实验数据； 附件 4：专利权人市售 CleanCap® Reagent AG（m7GpppA pG）、CleanCap® Reagent AG 3’OMe2'OMe（m7G pppA pG）和CleanCap® Reagent AU（m7Gppp pU）产品手册。 3'OMe 2'OMe A2'OMe至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。

1、审查基础专利权人于2025年02月27日对权利要求书进行了修改，将授权公告的权利要求10、33中的技术特征“R 为O-甲基”限定入独立权利要求1、32中，删除权利要求9、10，并相应修改权利要求的编号。请求3人对于所述修改未提出异议。经审查，专利权人此次所作修改符合专利法第33条以及《专利审查指南》关于无效程序中权利要求修改的相关规定。因此，本无效审查决定所依据的文本为：专利权人于2025年02月27日提交的权利要求第1-43项，以及授权公告的其它内容。 2、关于专利法第26条第3款专利法第26条第3款规定：说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。 要求保护的发明为化学产品本身的，说明书中应当记载化学产品的确认、制备以及用途。对化学产品结构的说明应当明确到使本领域的技术人员能确认该化学产品的程度；此外，说明书中应当记载至少一种制备方法，说明实施所述方法所用的原料物质、工艺步骤和条件、专用设备等，使本领域的技术人员能够实施所述方法并制备得到相应的化学产品。如果基于现有技术状况以及说明书的记载，本领域技术人员无法确认要求保护的化学产品能够得到，则说明书对该化学产品未作出清楚、完整的说明。 2.1关于权利要求1-43中“复合体”的含义本案中，独立权利要求1保护一种复合体，其包含起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板，并限定了起始加帽寡核苷酸引物的结构，从权利要求1图示的结构以及基团的限定来看，所述起始加帽寡核苷酸引物为7- 甲基鸟苷（即帽结构，参见本专利说明书第0014段）通过三磷酸连接了两个核苷酸，并限定了两个核苷酸中可能的修饰；权利要求1还限定了DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区域，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸；以及其中所述起始加帽寡核苷酸引物与所述DNA模板至少在核苷酸位置+1和+2处杂交。独立权利要求30保护一种复合体，与权利要求1的结构类似，区别之处在于起始加帽寡核苷酸引物为7-甲基鸟苷通过三磷酸连接了三个核苷酸，起始加帽寡核苷酸引物与所述DNA模板至少在核苷酸位置+1、+2和+3处杂交。其它从属权利要求分别对独立权利要求中起始加帽寡核苷酸引物的基团进行了具体限定。 专利权人当庭明确，所要求保护的复合体中，起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板通过碱基配对形成结合状态，并且不必须同时有聚合酶的存在；模板在本专利的实施例中使用的是双链的，双链打开引物才能与其中一条链结合。因此，权利要求中的复合体在模板是双链时，双链被打开，引物与其中一条链杂交，形成复合体；对于模板是单链的情况，按照权利要求的字面意思，为引物与单链直接杂交，形成复合体。本决定下文中的“复合体”均指加帽寡核苷酸引物和DNA模板通过上述结合形成的复合体，除非明确指明是别的不同结构的复合体。 2.2说明书中的相关记载及双方意见说明书第0089段记载了在起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板的复合体中“互补”的含义，以及核苷酸的选择范围等。说明书第0187段记载了“杂交序列的存在促使起始加帽寡核苷酸引物主要仅以期望的方向(即， “正向”方向)在起始位点与DNA模板的互补序列对齐。在正向方向，RNA转录物始于反向鸟苷残基(即， 7mG(5′)ppp(5′)N…)。DNA模板上引物对齐的正向方向相对于不正确的“反向”方向的优势地位通过杂交复合体的热力学维持。后者是通过起始加帽寡核苷酸引物的杂交序列的长度和与DNA模板的杂交所涉及的碱基的特性来确定的。在期望的正向方向下的杂交也可以取决于DNA模板和起始加帽寡核苷酸引物杂交的或用于体外转录期间的温度和反应条件”。 说明书第17-22页“转录”一节中记载了关于转录过程的部分现有技术：在真核细胞中，信使RNA(mRNA) 的转录由RNA聚合酶II完成；为了在体外进行大规模转录，研究通常使用源自T7（即T7 RNAP，本专利重点讨论的酶）、T3、SP6、K1‑5、K1E、K1F或K11噬菌体的单亚基噬菌体聚合酶；T7 RNAP以至少两种蛋白质状态存在。第一种被称为“无效(顿挫型，abortive)复合体”并且与转录起始相关。第二种是非常进行性的构象，称为“延伸复合体”。体外转录可以分成六个步骤：1)RNA聚合酶结合启动子序列，2)转录起始，3)非进行性延伸，被称为无效转录，在此期间聚合酶频繁地释放DNA模板和短小的无效转录物，4)开放复合体转化为封闭复合体，5)进行性延伸，以及6)转录终止。转录期间产生的大量RNA由长度为2‑8个核苷酸的短小无效片段组成(Biochemistry19:3245‑3253(1980)；NucleicAcidsRes.9:31‑45(1981)；NucleicAcidsRes.15： 8783‑8798(1987)；Biochemistry27:3966‑3974(1988))。合成约 10–14 个碱基后，RNA 聚合酶从无效循环逃脱， 同时失去与启动子DNA的序列特异性接触，并且形成进行性延伸复合体，其中RNA链以序列非依赖性方式延 伸 (J.Mol.Biol.183:165‑177(1985) ； Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:3614‑3618(1986) ； Mol.CellBiol.7:3371‑3379(1987))；T7 RNAP在不存在引物的情况下起始RNA合成。起始中的第一步骤被称为从头(de novo)RNA合成，其中RNA聚合酶识别DNA模板上的特定序列，选择与在位置+1和+2处的模板残基互补的第一对核苷酸三磷酸，并且催化形成磷酸二酯键以形成二核苷酸；T7 RNAP还可以用短小寡核苷酸引物起始，包括无帽寡核苷酸和加帽寡核苷酸（参见第160、161、165、167-183段）。 说明书实施例1-7记载了不同的加帽寡核苷酸引物的制备方法，实施例8记载了用于制备pN( )pN2’-OR1二核苷酸(R1＝H或Me)的一般程序，实施例9记载了用于合成具有帽0、帽1或帽2结构的起始寡核苷酸的一般程序，实施例10列举了加帽寡核苷酸引物的结构，实施例11记载了用ARCA引物在体外转录，实施例12记载了用三聚体起始加帽寡核苷酸引物在体外转录，实施例13记载了用四聚体起始加帽寡核苷酸引物在体外转录，实施例14-15分别记载了m7GpppA pG三聚体起始加帽寡核苷酸引物和TC模板/CC模板的2’Ome体外转录，实施例16记载了翻译mRNA实验方法，实施例17记载了采用6mM起始加帽寡核苷酸引物、1.5mMGTP（低GTP浓度）的不同起始加帽寡核苷酸引物生成的mRNA的加帽效率的试验，实施例18-19记载了用m7GpppA pG起始加帽寡核苷酸分别和TC模板和CC模板的比较。 2’Ome请求人认为，本专利说明书实施例1-19均没有明确表征权利要求所保护的“包含起始加帽核苷酸引物和DNA模板”的“复合体”是否存在。其中，实施例12-15，17-18均描述的是模板和加帽引物的组合物（分别加入，而非加入已配对形成的复合体）进行实验，而实施例16和19描述的是形成的RNA产物（仅加帽RNA产物，无模板，无复合体）的后续实验；均不能证明是权利要求1中的复合体产生了各个实验中的技术效果。 本专利说明书中未对复合体进行表征确认，也未提供测定证明复合体存在的实验方法，无法证明其可分离、 可获取。因此，说明书对于权利要求1-43的技术方案未充分公开，不符合专利法第26条第3款的规定。 专利权人认为，本专利使用制备得到的加帽寡核苷酸引物，并基于本专利要求的杂交关系选取DNA模板，进一步获得了本专利的复合体，并通过本专利说明书记载的分析方法证实了所得到的复合体能克服加帽寡核苷酸引物在体外起始转录时，为了抑制GTP与加帽寡核苷酸引物竞争而必须使用低浓度GTP，从而导致的加帽效率低、mRNA产率低和形成的mRNA的质量低的问题。因此，本领域技术人员根据本专利说明书的记载结合本领域的常识，能够确认本专利要求保护的复合体，并确信其用于体外转录能获得高加帽效率、 高产量的mRNA加帽产物和高翻译活性。 2.3相关证据及双方意见请求人和专利权人均未提交直接的现有技术证据表明权利要求1的复合体能够制备得到或不能制备得到， 但均例举了与权利要求1的复合体存在一定联系的现有技术进行类推。 2.3.1关于质证意见双方在书面意见以及当庭陈述的意见中涉及专利法第26条第3款的现有技术证据有：证据1（包括反证11中的补充译文）、证据15、证据16（包括反证17中证据16的补充译文）、证据20（包括反证18以及专利权人当庭提交的证据20的补充译文）、证据24，以及反证1（包括证据26中反证1的补充译文）、反证2。双方对上述证据及反证的真实性、关联性、公开时间、译文准确性及对方补充提交的译文均无异议，合议组对此予以确认。 除上述现有技术证据外，涉及专利法第26条第3款的还有非现有技术证据，包括证据25和反证3，双方将其作为支持各自观点的佐证。证据25为请求人在IDT相关网页查询的Tm值，专利权人对证据25的真实性未提出异议，但认为Tm值受到诸多因素的影响，简单的模拟计算数值并不能直接用于证明本专利复合体的稳定性，因此，证据25与本专利不具有关联性。合议组认为，IDT网站是本领域常用的在线工具平台， 虽然Tm值受到浓度、离子强度等因素的影响，但对于判断一段序列Tm值的大致范围来说，其仍有一定的参考价值，合议组认可其关联性，将在下文评述。反证3为优先权日后发表的论文，请求人对其未提出异议， 合议组将在下文对其进行评述。 2.3.2关于反证1反证1公开了一种构建体。该构建体由一条长度为20nt的RNA链组成，其3'末端上的12nt长RNA链与所述DNA模板链完全互补，剩余的8nt长RNA链与所述DNA模板链不互补，由此形成一条游离（单链）RNA尾部的开端。额外的DNA寡核苷酸作为所述构建体中的非模板链。所述DNA非模板链与所述DNA模板链仅部分互补，形成一个永久未配对的DNA泡，所述DNA泡容纳RNA链的互补部分，并使其在泡内对模板链进行退火处理。通过改变组成寡核苷酸的长度和序列，该构建体的各组成部分（即双链片段的长度、 RNA-DNA杂交体的长度以及非互补DNA泡的大小）均可发生变化（图1）。图2示出了RNA聚合酶与稳定的核酸构建体结合。在大肠杆菌核心RNA聚合酶不存在和存在的两种情况下，通过条带位移测定法解析非变性聚丙烯酰胺凝胶上的游离RNA、所述引物-模板复合体和所述RNA-DNA转录泡双链体（图2扩号中内容为专利权人标注）。 反证1图1反证1图2请求人在证据26中补充了反证1第1320段右侧栏的如下译文：“我们利用DNA和RNA寡核苷酸组装了合成核酸构建体，旨在避免这些困难，并产生特定位置转录延伸复合物的明确且均一的溶液。这些构建体结合了延伸复合物的结构特性，并且我们设计它们以绕过对启动子的需求。其主要特征是一个预先存在的DNA气泡，两侧为双链DNA，这使得与模板链互补的RNA引物能够在气泡内形成特定位置的RNA-DNA杂交体。原则上，应该可以直接将核心RNA聚合酶‘反式’添加到这些构建体中，从而获得特定位置且具有功能的延伸复合物”。 专利权人认为，反证1图2的道4中显示了RNA分子与DNA双链杂交形成的复合体（其位置位于RNA分子与DNA模板、RNA聚合酶形成的超聚体之下），这表明即使在RNA聚合酶存在的情况下，也并非所有RNA分子与DNA双链杂交复合体会与RNA聚合酶结合，进一步表明RNA分子与DNA双链杂交复合体的形成不需要RNA聚合酶的存在。因此，反证1的图2明确地显示了DNA模板和RNA引物之间可以直接结合形成复合体，该复合体是稳定的、可以独立存在的，并且不需要RNA聚合酶的存在即可以形成；DNA模板和RNA引物之间形成复合体之后再与RNA聚合酶结合。基于本领域的上述理解，本专利说明书不但使得本领域技术人员能够确认权利要求1-43所保护的复合体，本领域技术人员也能相应地获取并分离所述复合体。 请求人认为，（1）反证1的双链DNA的非模板链在气泡区包含一段非配对区，以防止其影响模板链与RNA引物杂交，这点和专利中所有实施例的情形均不同（本专利采用的是完全配对的双模板链）；（2）其双链DNA模板链中没有启动子序列，这点也和专利中所有实施例的情形均不同；（3）其设计的RNA引物含有20个碱基（12个配对碱基、8个不配对碱基），这点与本专利所保护的3个碱基（2个配对、1个不配对）的起始加帽引物有明显区别。（4）反证1研究的是RNA聚合酶的延伸复合物，即图中泳道4中专利权人称之为“RNA聚合酶和转录泡双链体形成的超聚体”的物质，而非起始复合物，反证1的实验结果是在体外、特定条件下的延伸转录泡中获得的，并不能证明含有RNA引物的起始阶段的转录泡，也能获得相同稳定结果。 2.3.3关于证据1、15、16、20、24证据1图3示意了从头合成和三聚体RNA形成过程的核苷酸掺入方案：（a）从头合成过程中核苷酸结合位点的排列，其中D位点（橙色椭圆形）和P位点（绿色椭圆形）分别表示第一和第二起始核苷酸的结合位点。这些位点位于延伸核苷酸结合位点（N位点，粉红色椭圆形）的上游。模板DNA（蓝色）上的转录起始位点编号为+1。（b）第三核苷酸的掺入。第三NTP在没有二核苷酸易位的情况下与N位点（粉红色椭圆形）结合，然后与P位点（绿色椭圆形）二核苷酸的3’-OH反应形成三聚体RNA。RNAP仅使用P位点和N位点进行随后的核苷酸循环掺入（参见证据1的图3及其图释的译文）。 证据15记载了转录过程中，RNA聚合酶（淡蓝色）沿着DNA逐步移动，在其活性位点解开DNA螺旋。 随着它的进展，聚合酶将核苷酸（表示为小“T”形）一个接一个地添加到RNA链的聚合位点，使用暴露的DNA链作为模板。因此，RNA转录物是两条DNA链之一的互补拷贝。其中，DNA/RNA螺旋的短区域（长度约为9个核苷酸对）仅短暂形成，该DNA/RNA螺旋的“窗口”与聚合酶一起沿着DNA移动（参见证据15的图6-8及图释的译文）。 证据16记载了：“流产寡核苷酸启动”是T7RNA聚合酶的一般特性，还是这种行为是模板和/或序列特异性的，还有待确定。最后，我们注意到，只要与启动子区域保持序列互补性，大肠杆菌RNA聚合酶就可以通过二核苷酸或三核苷酸引发RNA聚合。似乎短寡核苷酸也需要这种相同的序列限制来启动T7RNA聚合酶。这种启动特性，以及流产循环，可能适用于所有RNA聚合酶，并可能源于RNA生物聚合复杂过程所施加的类似机制约束（参见证据16第10439页右侧第2段译文）。 证据20记载了：为什么需要底物特异性？——由于单碱基对的稳定性不足以提供底物正确定位所需的能量，因此很容易想象RNA聚合酶将如何进化从而为起始核苷酸的结合和定位提供额外的稳定性。注意，DNA聚合酶，或延伸阶段的RNA聚合酶，不需要此类相互作用，因为对应的“起始”核苷酸被共价连接到延伸中的DNA或RNA引物，并通过与之共价连接的5’端相邻碱基形成碱基堆叠，获得额外的稳定性，这个问题只存在于从头起始（参见专利权人当庭提交的证据20的补充译文）。 证据24记载了：尽管存在结构差异，来自噬菌体T7的99-kD单亚基RNA聚合酶（T7RNAP）与多亚基的细胞RNA聚合酶（RNAPs）在功能上具有许多共同特征。这两类RNA聚合酶都具有转录的起始和延伸阶段。在起始阶段，RNAP结合到特定的DNA启动子，在转录起始位点打开双链，并从头（denovo）开始RNA合成。这一阶段的转录不稳定，其特征是反复的流产起始事件，产生短RNA片段[2至6个核苷酸（nt）]。在合成10至12个核苷酸长的RNA后，聚合酶进入延伸阶段，并持续完成mRNA的转录，直到终止。起始状态和延伸状态之间存在显著的生化差异。足迹分析显示DNA保护模式不同。T7RNAP-DNA复合物在延伸阶段更加稳定，而T7溶菌酶，T7RNAP的天然抑制剂，抑制从起始状态向延伸状态的转变，但对正在转录的延伸复合物的活性影响较小（参见证据24第1387段译文）。 双方对于上述证据的意见如下： 请求人认为：上述证据以及本专利说明书第161段记载的内容表明，转录起始阶段都需要RNA聚合酶的存在；起始复合物和延伸复合物是RNA聚合酶行使转录功能过程的两种不同转录阶段的复合物，本专利的复合体更接近于起始复合物，但起始复合物不稳定，而反证1中描述的是延伸复合物，不能证明本专利的复合体是稳定的。 专利权人认为：证据24公开的是RNA聚合酶的不同结构，并非RNA-DNA复合体的不同结构，RNA聚合酶在不同阶段的结构不同，与RNA-DNA异源双链体具有不同的亲和力，但其并不影响通过碱基配对形成的RNA-DNA异源双链体本身的存在和稳定性；证据1、15、16描述了从头合成的过程，与本专利基于加帽引物进行体外转录的过程不同；证据20说明了从头合成过程中单碱基对的稳定性不足以提供底物正确定位所需的能量，本专利中是二碱基对或者三碱基对，不是单碱基对，并且本专利是基于加帽引物进行体外转录，不是从头合成，证据20并没有证据加帽的三聚体或者四聚体引物无法与模板形成稳定复合体。本领域技术人员可以通过使用自身带有由不匹配的核酸片段形成的转录泡的DNA双链模板与RNA引物杂交，或者使用DNA单链模板与RNA引物杂交，也可以使用传统的双链DNA模板与RNA引物杂交，而无论以何种方式打开DNA模板的螺旋，RNA/DNA复合体通过沃森/克里克碱基配对规则形成稳定的复合体。因此，RNA聚合酶既没有直接参与到DNA/RNA复合体的碱基配对中，也不影响通过沃森/克里克碱基配对规则形成的RNA/DNA复合体的存在和稳定性。 2.3.4关于证据25、反证3证据25为请求人在IDT相关网页查询的Tm值。查询结果显示，2个或3个碱基配对的起始加帽核苷酸引物和DNA模板的Tm值为0℃；反证1中采用的12个碱基配对的情形，其Tm值为71.6℃；证据24中10个碱基配对的情形，其Tm值为62.7℃。 反证 3 为本专利优先权日后发表的论文，其中记载了：在启动“光速项目（Project Lightspeed）”（BioNTech-辉瑞公司联合开发COVID-19RNA疫苗的项目）11个月后，BNT162b2成为首个获准紧急使用的疫苗。BNT162b2包含一种符合药品生产质量管理规范等级、密码子优化的mRNA药物物质……。在1- 甲基假尿嘧啶-5’-三磷酸（赛默飞世尔科技公司（ThermoFisherScientific））代替尿嘧啶-5’-三磷酸的情况下，通过体外转录从DNA模板生成RNA。使用三核苷酸帽1类似物（(m 7,3’-O)Gppp(m2’-O)ApG）（TriLink2公司（即本专利专利权人））通过共转录进行加帽（参见反证3译文）。 请求人认为，权利要求1、32中所述的三聚（四聚）核苷酸帽子引物复合体的Tm值为0℃左右，同时长度短，键能小，非常不稳定，通常denovo合成中也会产生大量2、3、4个核苷长度的流产产物，一般在延伸至10-20个核苷后复合体才会稳定，证据25表明本专利的复合体是不稳定的。反证3中并未公开引物与模板结合的情况（+1、+2位杂交）及其复合体的存在，并不能说明BNT162b2等疫苗直接使用了本专利保护的技术方案。 专利权人认为，Tm值受到诸多因素的影响，简单的模拟计算数值并不能直接用于证明本专利复合体的稳定性。反证3表明辉瑞公司正是采用了本专利的技术方案，使得其BNT162b2疫苗在短时间内完成研发并实现大规模量产。显然，本专利的技术方案在下游产业应用上得到了广泛的认可，产生了巨大价值。 2.4合议组意见结合双方提交的有关说明书是否公开充分的证据及意见陈述，可以确认：双方均认可，在从头合成中， RNA起始转录过程通常包括1)RNA聚合酶结合启动子序列，2)转录起始，3)非进行性延伸，被称为无效转录，在此期间聚合酶频繁地释放DNA模板和短小的无效转录物，4)开放复合体转化为封闭复合体，5)进行性延伸，以及6)转录终止6个步骤，而本专利涉及的不是从头合成RNA，是通过起始加帽引物来进行体外转录合成RNA。双方争议焦点主要在于：（1）利用起始加帽引物来进行体外转录合成RNA时，本领域技术人员基于现有技术能否确认可以制备得到本专利的复合体；（2）基于本专利说明书的记载，本领域技术人员是否能够确认已得到了所述复合体。对于以上争议焦点，合议组认为： （1）关于本领域技术人员基于现有技术能否确认可以制备得到本专利的复合体。首先，证据1、15、 16、20、24以及本专利第161段中记载的现有技术信息表明，在RNA从头合成时，需要RNA聚合酶结合到模板上以后打开双链才能起始转录，而且早期合成的较短的核苷酸不稳定，在超过约10个碱基后，才进入稳定的延伸阶段。由此，本领域技术人员可以认识到，DNA-DNA双链模板的键能较大，通常需要RNA聚合酶介入才能够打开形成单链，从而形成起始核苷酸或引物进入的空间，而且单个核苷酸或早期合成的较短核苷酸与模板链之间键能以及碱基堆积力等其他作用力通常不足以保证复合体的稳定存在，从而导致出现反复流产的现象。可见，复合体能否形成并稳定存在依赖于键能和碱基堆积力等作用力的强弱，对于双链模板还依赖于能否形成单链以获得核苷酸或引物进入的空间，上述对作用力和空间的要求对于从头合成还是使用起始加帽引物合成而言，并无实质区别，在此前提下，由于本专利要求保护的复合体中，起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板只有两个或三个碱基能够杂交，而且其并未限定与RNA聚合酶同时形成复合体，因此本专利要求保护的复合体既不同于转录中的起始复合物，也不同于延伸复合物，其作用力和空间形成效果与复合体结构之间的构效关系尚不明确，因而，本领域技术人员无法预期所述复合体能够形成。其次，在缺少RNA聚合酶时，引物与双链DNA模板的结合首先要通过某些技术手段将双链解开，再使双链中的一条链与引物结合。例如反证1中，设计了DNA非模板链与DNA模板链仅部分互补，形成一个永久未配对的DNA泡， 即反证1中设计了一条已打开的DNA双链模板，而且其RNA与DNA模板链的互补碱基达到12个，如此才能在缺少RNA聚合酶的基础上形成复合体。而本专利中，未记载DNA模板经特殊处理，结合申请文件的记载及专利权人的当庭陈述应理解为完全互补的双链DNA模板，在缺少RNA聚合酶的情况下，依据以上现有技术记载的内容难以确认可以打开双链DNA模板，并且仅依靠二至三对互补碱基的结合力形成复合体。 专利权人虽然提出证据20仅强调了单碱基对的稳定性不足，不能说明加帽的三聚体或者四聚体引物无法与模板形成稳定复合体，但其并没有给出证据证明此情况下能够形成复合体。即使模板为单链，也依然面临上述结合力较弱的问题，而且本专利实施例中使用的是双链模板，使用单链模板的方案能否形成用于后续转录的复合体同样缺少证据支持。至于专利权人主张的类似反证1中自身带有由不匹配的核酸片段形成的转录泡的DNA双链模板与RNA引物杂交，首先，说明书中并未记载此类情形；其次，反证1中的所述结构中互补碱基数远远在于本专利中的2至3个，而且反证1中的模板中不含启动子，RNA序列也不属于加帽引物，也不能证明在本专利权利要求限定的条件下能够形成复合体。而且请求人提交的证据25表明，2个或3个碱基配对的起始加帽核苷酸引物和DNA模板的Tm值为0℃，表明所述引物与模板的结合极不稳定。虽然专利权人认为有其它因素会影响上述Tm值，但由于其Tm值极低，即使考虑到其它因素的影响也难以预期所述复合体在所述反应体系中能够形成。反证3中仅记载BNT162b2中使用了专利权人公司的三核苷酸帽1类似物， 即本专利中的加帽寡核苷酸引物，并未记载使用了本专利中的复合体，另外，专利权人也在口头审理中确认本专利的产品并非以复合体的形式进行销售，反证3并不能佐证本专利的复合体能够制备得到并具有可用作转录合成RNA的原料的用途。 （2）关于基于本专利说明书的记载，本领域技术人员是否能够确认已得到了所述复合体。综合说明书记载的内容整体来看，说明书中仅概述了引物和DNA模板形成复合体，以及二者形成正向对齐依赖于加帽寡核苷酸引物的杂交序列的长度、与DNA模板的杂交所涉及的碱基的特性、杂交的或用于体外转录期间的温度和反应条件等形成杂交复合体的热力学维持，但说明书中并未记载具体的热力学数据，如杂交序列的长度、 温度和反应条件具体为何时能形成复合体。说明书实施例中仅记载了引物的合成方法以及体外转录和翻译的方法，转录方法是在溶液中添加模板、引物、RNA聚合酶、GTP、ATP、CTP、UTP、MgCl 等成分进行反2应，既未将复合体本身作为原料进行反应，也未对反应过程中存在复合体进行测定、确认和表征，实施例的实验结果仅测定了转录和翻译的最终产物，而不是引物与模板形成的复合体，仅能表明按照以上述方法能够有效地转录，但由于该反应是在添加了RNA聚合酶的体系中进行的，并不能证明在未添加RNA聚合酶时， 能形成复合体；也不能证明在反应过程中，溶液中形成了复合体再与RNA聚合酶结合进行转录，即说明书记载的内容不足以表明所述复合体的制备、确认和表征已经完成。相应地，所述转录方法的用途和效果也不能认为是复合体的用途和效果。 综上，本领域技术人员依据现有技术，并不能预期本专利的复合体能够制备得到，而本专利说明书中也未记载该产品的确认、制备以及用途，因此，说明书对权利要求1-43的产品未作出清楚、完整的说明，不符合专利法第26条第3款的规定。 此外，专利权人还引用反证2说明在某些RNA分子中用T来表示U，因此本专利第89段的示例性描述中5’-A-G-T-C-3’、“3’-T-C-A-G-5’互补形成的序列并非指DNA聚合酶引物和DNA模板形成的“复合体”，而应结合上下文理解为是起始加帽寡核苷酸引物和DNA模板的复合体。该反证及意见不影响上述结论。 对于专利权人庭后提交的附件1-4，首先，上述证据的提交日期已超出举证期限，而且未经请求人质证， 合议组不予考虑。专利权人提交的其它反证均不涉及专利法第26条第3款的无效理由，不影响上述认定，合议组不再单独评述。 鉴于已得出上述结论，合议组对请求人的其它无效理由和证据不再评述。 基于以上事实和理由，合议组作出如下无效审查决定。

宣告202310734863.0号发明专利权全部无效。 当事人对本决定不服的，根据专利法第46条第2款的规定，可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人应当作为第三人参加诉讼。 合议组组长：邹凯主审员：韩世炜 专利局复审和无效审理部参审员：张弛